Профілювання рослинних гормонів є складним аналітичним завданням, оскільки ці сполуки містяться в тканинах у нанокількостях разом із численними інтерферуючими речовинами вищої концентрації. Цитокініни, які беруть участь у регуляції всіх життєво важливих функцій організму, включно з поділом клітин, формуванням меристем, відповіддю на негативний вплив довкілля, фотосинтезом, старінням, поглинанням макро- і мікроелементів, утворюють один із найважливіших класів фітогормонів. У статті схарактеризовано фітогормони цитокінінової природи, коротко розглянуто історію ідентифікації цих сполук аналітичними методами. Наголошено на важливості методичних розробок визначення цитокінінів у рослинних тканинах для вирішення завдань сучасної фізіології рослин. Детально описано новітні методичні прийоми одночасного кількісного аналізу п’яти форм цитокінінів. Схарактеризовано чутливий метод кількісного аналізу, який ґрунтується на хроматографічному розділенні речовин-аналітів та одноквадрупольній мас-спектрометрії з інтерфейсом іонізації «електроспрей». Основою розробленого нами аналітичного методу ВЕРХ/ЕС-МС є ефективне градієнтне хроматографічне розділення речовин аліквот проб у поєднанні з відповідними процедурами екстракції та очищення зразків. Наголошено, що екстракція в системі розчинників із наступним очищенням у двох картриджах твердофазної екстракції дають змогу ефективно і швидко ізолювати цитокініни з рослинного матеріалу. Розроблений метод ВЕРХ/ЕС-МС має високу роздільну здатність і селективність, достатньо чутливий для визначення природних рівнів цитокінінів і з’ясування їхніх фізіологічних ефектів у органах і тканинах. Досліджувані цитокініни ми визначали як домінуючі квазімолекулярні іони [M+H]+ з межею виявлення нижче за 0,5 нг у мікролітрі екстракту. Пропонований метод кількісного аналізу, що використовує переваги високоефективного хроматографічного розділення речовин і чутливого мас-спектрометричного детектування, є корисним інструментом для фізіологів рослин і біохіміків при вивченні участі гормонів класу цитокінінів у регуляції процесів росту й розвитку, у формуванні стратегії адаптації рослин за дії абіотичних і біотичних стресорів.
Ключові слова: цитокініни, твердофазна екстракція, високоефективна рідинна хроматографія, мас-спектрометрія, профілювання
Повний текст та додаткові матеріали
У вільному доступі: PDFЦитована література
1. Davies, P.J. (2010). The Plant Hormones: Their Nature, Occurrence, and Functions. Davies, P.J. Plant Hormones, Springer, Dordrecht, pp. 1-15. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-2686-7_1
2. Dun, E.A., Brewer, P.B. & Beveridge, C.A. (2009). Strigolactones: discovery of the elusive shoot branching hormone. Trends Plant Sci., 14, No. 7, pp. 364-372. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2009.04.003
3. Pan, X., Welti, R. & Wang, X. (2008). Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Phytochemistry, 69, No. 8, pp. 1773-1781. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2008.02.008
4. Vedenicheva, N.P. & Kosakivska, I.V. (2017). Cytokinins as regulators of plant ontogenesis under different growth conditions. Nash format, Kyiv [in Ukrainian].
5. Schaller, G.E., Street, I.H. & Kieber, J.J. (2014). Cytokinins and the cell cycle. Current Opinion in Plant Biology, 21. pp. 7-15. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2014.05.015
6. Kurepa, J., Shull, T.E. & Smalle, J.A. (2019). Antagonistic activity of auxin and cytokinin in shoot and root organs. Plant Direct, 3, pp. 1-9. https://doi.org/10.1002/pld3.121
7. Honig,M., Plihalova, L., Husickova, A., Nisler, J. & Dolezal, K. (2018). Role of Cytokinins in Senescence, Antioxidant Defence and Photosynthesis. Int. J. Mol. Sci., 19, pp. 4045. https://doi.org/10.3390/ijms19124045
8. Pavlu, J., Novak, J., Koukalova, V., Luklova, M., Brzobohaty, B. & Cerny, M. (2018). Cytokinin at the crossroads of abiotic stress signaling pathways. Int. J. Mol. Sci., 19, pp. 2450. https://doi.org/10.3390/ijms19082450
9. Bielach, A., Hrtyan, M. & Tognetti, V.B. (2017). Plants under stress: Involvement of auxin and cytokinin. Int. J. Mol. Sci., 18, No. 7, pp. 1427. https://doi.org/10.3390/ijms18071427
10. Cortleven, A., Leuendorf, J.E., Frank, M., Pezzetta D., Bolt, S. & Schmulling, T. (2019). Cytokinin action in response to abiotic and biotic stress in plants. Plant Cell Environ., 42, No. 3, pp. 998-1018. https://doi.org/10.1111/pce.13494
11. Werner, T. & Schmulling, T. (2009). Cytokinin action in plant development. Current Opinion in Plant Biology, 12, No. 5, pp. 527-538. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2009.07.002
12. Ha, S., Vankova, R., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. & Tran, L-S.P. (2012). Cytokinins: metabolism and function in plant adaptation to environmental stresses. Trends Plant Science, 17, No. 3, pp. 172-179. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2011.12.005
13. Diopan, V., Adam, V., Havel, L. & Kizek, R. (2009). Phytohormones as important biologically active molecules - their simple simultaneous detection. Molecules, 14, No. 5, pp. 1825-1839. https://doi.org/10.3390/molecules14051825
14. Romanov, G.A., Lomin, S.N. & Schmulling, T. (2018). Cytokinin signaling: from the ER or from the PM? That is the question! New Phytologist, 218, No. 1, pp. 41-53. https://doi.org/10.1111/nph.14991
15. Frebort, I., Kowalska, M., Hluska, T., Frebortova, J. & Galuszka, P. (2011). Evolution of cytokinin biosynthesis and degradation. J. Exp. Bot., 62, No. 8, pp. 2431-2452. https://doi.org/10.1093/jxb/err004
16. Vedenicheva, N.P. & Kosakivska, I.V. (2016). Modern aspects of cytokinins studies: evolution and crosstalk with other phytohormones. Fiziol. rast. genet., 48, No. 1, pp. 3-19 [in Ukrainian]. https://doi.org/10.15407/frg2016.01.003
17. Sakakibara, H. (2006). Cytokinins: Activity, biosynthesis and translocation. Ann. Rev. Plant Biology, 57, pp. 431-449. https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.57.032905.105231
18. Voytenko, L.V. & Kosakivska, I.V. (2016). Polyfunctional phytohormone abscisic acid. The Bulletin of Kharkiv national agrarian university, 1, No. 37. pp. 27-41 [in Ukrainian].
19. Chernyad'ev, I.I. (2009). The protective action of cytokinins on the photosynthetic machinery and productivity of plants under stress (review). Appl. Biochem. Microbiol., 45, pp. 351-362. https://doi.org/10.1134/S0003683809040012
20. Cutler, S.R., Rodriguez, P.L., Finkelstein, R.R. & Abrams, S.R. (2010). Abscisic Acid: Emergence of a Core Signaling Network. Ann. Rev. Plant Biol., 61, pp. 651-679. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-042809-112122
21. Dobrev, P.I. & Vankova, R. (2012). Quantification of Abscisic Acid, Cytokinin, and Auxin Content in Salt-Stressed Plant Tissues. Shabala, S., Cuin, T. (Eds.) Plant Salt Tolerance (Methods and Protocols), Humana Press, Totowa, NJ, pp. 251-261. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-986-0_17
22. Netting, A.G. (2000). pH, abscisic acid and the integration of metabolism in plants under stressed and non-stressed conditions: cellular responses to stress and their implication for plant water relations. J. Exp. Bot., 51, No. 343, pp. 147-158. https://doi.org/10.1093/jexbot/51.343.147
23. Tarkowska, D., Novak, O., Flokova, K., Tarkowski, P., Tureckova, V., Gruz, J., Rolcik, J. & Strnad, M. (2014). Quo vadis plant hormone analysis? Planta, 240, pp. 55-76. https://doi.org/10.1007/s00425-014-2063-9
24. Kurakawa, T., Ueda, N.; Maekawa, M., Kobayashi, K., Kojima, M., Nagato, Y., Sakakibara, H. & Kyozuka, J. (2007). Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme. Nature, 445, No. 7128, pp. 652-655. https://doi.org/10.1038/nature05504
25. Takei, K., Yamaya, T. & Sakakibara, H. (2004). Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin. J. Biol. Chem., 279, No. 40, pp. 41866-41872. doi: 10.1074/jbc.M406337200 https://doi.org/10.1074/jbc.M406337200
26. Mok, D.W.S. & Martin, R.C. (1994). Cytokinin metabolic enzymes. Mok, D.W.S., Mok, M.C. (Eds.) Cytokinins: chemistry, activity and function. Boca Raton: CRC Press, pp. 129-137. https://doi.org/10.1201/9781351071284-10
27. Kudo, T., Makita, N., Kojima, M., Tokunaga, H. & Sakakibara, H. (2012). Cytokinin activity of cis-zeatin and phenotypic alterations induced by overexpression of putative cis-zeatin-O-glucosyltransferase in rice. Plant Physiol., 160, pp. 319-331. https://doi.org/10.1104/pp.112.196733
28. Takagi, M., Yokota, T., Murofushi, N., Ota, Y. & Takahashi, N. (1985). Fluctuation of endogenous cytokinin contents in rice during its life cycle - quantification of cytokinins by selected ion monitoring using deuterium-labelled internal standards. Agr. Biol. Chem., 49, pp. 3271-3277. https://doi.org/10.1271/bbb1961.49.3271
29. Vyroubalova, S., Vaclavikova, K., Tureckova, V., Novak, O., Smehilova, M., Hluska, T., Ohnoutkova, L., Frebort, I. & Galuszka, P. (2009). Characterization of new maize genes putatively involved in cytokinin metabolism and their expression during osmotic stress in relation to cytokinin levels. Plant Physiol., 151, No. 1, pp. 433-447. https://doi.org/10.1104/pp.109.142489
30. Suttle, J.C. & Banowetz, G.M. (2000). Changes in cis-zeatin and cis-zeatin riboside levels and biological activity during potato tuber dormancy. Physiol. Plantarum., 109, No. 1, pp. 68-74. https://doi.org/10.1034/j.1399-3054.2000.100110.x
31. Emery, R.J.N., Leport, L., Barton, J.E., Turner, N.C. & Atkins, C.A. (1998). Cisisomers of cytokinins predominate in chickpea seeds throughout their development. Plant Physiol., 117, No. 4, pp. 1515-1523. https://doi.org/10.1104/pp.117.4.1515
32. Emery, R.J.N., Ma, Q. & Atkins, C.A. (2000). The forms and sources of cytokinins in developing white lupine seeds and fruits. Plant Physiol., 123, No. 4, pp. 1593-1604. https://doi.org/10.1104/pp.123.4.1593
33. Quesnelle, P.E. & Emery, R.J.N. (2007). Cis-cytokinins that predominate in Pisum sativum during early embryogenesis will accelerate embryo growth in vitro. Can. J. Bot., 85, pp. 91-103. https://doi.org/10.1139/b06-149
34. Dobra, J., Motyka, V., Dobrev, P., Malbeck, J., Prasil, I.T., Haisel, D., Gaudinova, A., Havlova, M., Gubis, J. & Vankova, R. (2010). Comparison of hormonal responses to heat, drought and combined stress in tobacco plants with elevated proline content. J. Plant Physiol., 167, No. 16, pp. 1360-1370. doi: 10.1016/j.jplph.2010.05.013 https://doi.org/10.1016/j.jplph.2010.05.013
35. Strnad, M. (1997). The aromatic cytokinins. Physiol. Plantarum, 101, No. 4, pp. 674-688. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1997.tb01052.x
36. Galuszka, P., Frebort, I., Sebela, M., Sauer, P., Jacobsen, S., & Pec, P. (2001). Cytokinin oxidase or dehydrogenase? Mechanism of cytokinin degradation in cereals. Eur. J. Biochem., 268, No. 2, pp. 450-461. doi: 10.1046/j.1432-1033.2001.01910.x https://doi.org/10.1046/j.1432-1033.2001.01910.x
37. Imbault, N., Moritz, T., Nilsson, O., Chen, H-J., Bollmark, M. & Sandberg, G. (1993). Separation and identification of cytokinins using combined capillary liquid-chromatography mass-spectrometry. Biol. Mass Spectrom., 22, No. 3, pp. 201-210. https://doi.org/10.1002/bms.1200220310
38. Astot, C., Dolezal, K., Moritz, T. & Sandberg, G. (1998). Precolumn derivatization and capillary liquid chromatographic/frit-fast atom bombardment mass spectrometric analysis of cytokinins in Arabidopsis thaliana. J. Mass Spectrom., 33, No. 9, pp. 892-902. https://doi.org/ 10.1002/(SICI)1096-9888(199809)33:9<892::AID-JMS701>3.0.CO;2-N https://doi.org/10.1002/(SICI)1096-9888(199809)33:9<892::AID-JMS701>3.0.CO;2-N
39. Nordstrom, A., Tarkowski, P., Tarkowska, D., Dolezal, K., Astot, C., Sandberg, G. & Moritz, T. (2004). Derivatization for LC-Electrospray Ionization-MS: a tool for improving reversed-phase separation and ESI responses of bases, ribosides, and intact nucleotides. Anal. Chem., 76, pp. 2869-2877. https://doi.org/10.1021/ac0499017
40. Novak, O., Tarkowski, P., Tarkowska, D., Dolezal, K., Lenobel, R. & Strnad, M. (2003.) Quantitative analysis of cytokinins in plants by liquid chromatography-single-quadrupole mass spectrometry. Anal. Chim. Acta., 480, pp. 207-218. https://doi.org/10.1016/S0003-2670(03)00025-4
41. Prinsen, E., Redig, P., Van Dongen, W., Esmans, E.L. 7 Van Onckelen, H.A. (1995). Quantitative analysis of cytokinins by electrospray tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom., 9, No. 10, pp. 948-953. https://doi.org/10.1002/rcm.1290091016
42. Witters, E., Vanhoutte, K., Dewitte, W., Machackova, I., Benkova, E., Van Dongen, W., Esmans, E.L. & Van Onckelen, H.A. (1999). Analysis of cyclic nucleotides and cytokinins in minute plant samples using phase-system switching capillary electrospray-liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Phytochem. Anal., 10, No. 3, pp. 143-151. https://doi.org/10.1002/(SICI)1099-1565(199905/06)10:3<143::AID-PCA441>3.0.CO;2-G
43. Yang, Y.Y., Yamaguchi, I., Kato, Y., Weiler, E.W., Murofuchi, N. & Takahashi, N. (1993). Qualitative and semi-quantitative analyses of cytokinins using LC/APCI-MS in combination with ELISA. J. Plant. Growth. Regul., 12, No. 21, pp. 21-25. https://doi.org/10.1007/BF00193674
44. Farrow, S.C. & Emery, R.J.N. (2012). Concurrent profiling of indole-3-acetic acid, abscisic acid, and cytokinins and structurally related purines by high-performance-liquid chromatography tandem electrospray mass spectrometry. Plant Methods., 8, p. 42. https://doi.org/10.1186/1746-4811-8-42
45. Muller, M. & Munne-Bosch, S. (2011). Rapid and Sensitive Hormonal Profiling of Complex Plant Samples by Liquid Chromatography Coupled to Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Plant Methods, 7, pp. 37. https://doi.org/10.1186/1746-4811-7-37
46. Novak, O., Hauserova, E., Amakorova, P., Dolezal, K. & Strnad, M. (2008). Cytokinin profiling in plant tissues using ultra-performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Phytochemistry, 69, No. 11, pp. 2214-2224. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2008.04.022
47. Campell, B.R. & Town, C.D. (1991). Physiology of hormone autonomous tissue lines derived from radiation-induced tumors of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 97, No. 3, pp. 1166-1173. https://doi.org/10.1104/pp.97.3.1166
48. Chory, J., Reinecke, D., Sim, S., Washburn, T. & Brenner, M. (1994). A role for cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis (Det mutants have an altered response to cytokinins). Plant Physiol., 104, No. 2, pp. 339-347. https://doi.org/10.1104/pp.104.2.339
49. Nicander, B., Stahl, U., Bjorkman, P.O. & Tillberg, E. (1993). Immunoaffinity co-purification of cytokinins and analysis by high-performance liquid chromatography with ultraviolet spectrum detection. Planta, 189, pp. 312-320. https://doi.org/10.1007/BF00194427
50. Pacakova, V., Stulik, K., Vlasakova, V. & Brezinova, A. (1997). Capillary electrophoresis of cytokinins and cytokinin ribosides. J. Chromatography A, 764, pp. 331-335. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(96)00927-2
51. Beres, T., Gemrotova, M., Tarkowski, P., Ganzera, M., Maier, V., Friedecky, D., Dessoyf, M.A., Wessjohannf, L.A., Spichal, L., Strnad, M. & Dolezal, K. (2012). Analysis of cytokinin nucleotides by capillary zone electrophoresis with diode array and mass spectrometric detection in a recombinant enzyme in vitro reaction. Anal. Chim. Acta, 751, pp. 176-181. https://doi.org/10.1016/j.aca.2012.08.049
52. Ge, L., Yong, J.W., Tan, S.N. & Ong, E.S. (2006). Determination of cytokinins in coconut (Cocos nucifera L.) water using capillary zone electrophoresis-tandem mass spectrometry. Electrophoresis, 27, pp. 2171-2181. https://doi.org/10.1002/elps.200500465
53. Hernandez, L., Hernandez, P., Rica, M. & Galan, F. (1995). Determination of zeatin in plant extracts by square wave stripping polarography and differential pulse stripping polarography. Anal. Chim. Acta, 315, pp. 33-39. https://doi.org/10.1016/0003-2670(95)00290-G
54. Huskova, R., Pechova, D., Kotoucek, M. & Lemr, K. (2000). Voltammetric behavior and determination of some cytokinines on mercury electrode. Chem. Listy, 94, pp. 1004-1009.
55. Tarkowska, D., Kotoucek, M. & Dolezal, K. (2003). Electrochemical reduction of 6-benzylaminopurine at mercury electrodes and its analytical application. Collect. Czech Chem. Commun., 68, pp. 1076-1093. https://doi.org/10.1135/cccc20031076
56. Liu, Z., Wei, F. & Feng, Y.-Q. (2010). Determination of cytokinins in plant samples by polymer monolith microextraction coupled with hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Methods, 2, pp. 1676-1685. https://doi.org/10.1039/c0ay00334d
57. Liu, X., Hegeman, A.D., Gardner, G. & Cohen, J.D. (2012). Protocol: high-throughput and quantitative assays of auxin and auxin precursors from minute tissue samples. Plant Methods, 8, pp. 31. https://doi.org/10.1186/1746-4811-8-31
58. Svacinova, J., Novak, O., Plackova, L., Lenobel, R., Holik, J., Strnad, M. & Dolezal, K. (2012). A new approach for cytokinin isolation from Arabidopsis tissues using miniaturized purification: pipette tip solid-phase extraction. Plant Methods, 8, p. 17. https://doi.org/10.1186/1746-4811-8-17
59. Liu, Z., Yuan, B.-F., Feng, Y.-Q. (2012). Tandem solid phase extraction followed by online trapping-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry for sensitive detection of endogenous cytokinins in plant tissues. Phytochem. Anal., 23, pp. 559-568. https://doi.org/10.1002/pca.2353
60. Du, F., Ruan, G., Liang, S., Xie, F. & Liu, H. (2012). Monolithic molecularly imprinted solid-phase extraction for the selective determination of trace cytokinins in plant samples with liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem., 404, No. 2, pp. 489-501. https://doi.org/10.1007/s00216-012-6131-3
61. Ge, L.Y., Tan, S., Yong, J.W.H. & Tan, S.N. (2006). CE for cytokinin analyses: A review. Electrophoresis, 27, pp. 4779-4791. https://doi.org/10.1002/elps.200600195
62. Liu, J. & Li, S.F.Y. (1996). Separation and determination of auxins by capillary electrophoresis. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 19, pp. 1697-1713. https://doi.org/10.1080/10826079608013998
63. Olsson, J.C., Andersson, P.E., Karlberg, B. & Nordstrom, A.C. (1996). Determination of plant indoles by capillary electrophoresis with amperometric detection. J. Chromatography A, 755, No. 2, pp. 289-298. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(96)00599-7
64. Zheng, B., Yang, H.X. & He, J.L. (1999). Quantitative analysis of plant hormones with capillary electrophoresis. Chin. J. Anal. Chem., 27, pp. 704-707.
65. Guidelines for the determination of phytohormones (1988). Kiev: Naukova Dumka [in Russian].
66. Kosakivska, I.V., Shcherbatiuk, M.M. & Voytenko, L.V. (2020). Profiling of hormones in plant tissues: history, modern approaches, use in biotechnology. Biotechnol Acta., 13, No. 4, pp. 14-25. https://doi.org/10.15407/biotech13.04.014
67. Shcherbatiuk, M.M., Voytenko, L.V., Vasyuk, V.A. & Kosakivska, I.V. (2020). Method for quantitative determination of phytohormones in plant tissues. Biol. Stud., 14, No. 2, pp. 117-136. [in Ukrainian]. https://doi.org/10.30970/sbi.1402.624
68. Sheikhian, L. & Bina, S. (2016). Simultaneous extraction and HPLC determination of 3-indole butyric acid and 3-indole acetic acid in pea plant by using ionic liquid-modified silica as sorbent. J. Chromatography B, 1009-1010. pp. 34-43. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2015.11.047
69. Annesley, T.M. (2003). Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry, 49, pp. 1041-1044. https://doi.org/10.1373/49.7.1041